Разработан метод расшифровки ДНК без секвенирования - 20 Августа 2010

Биохимикам удалось создать органический томограф, рассчитанный на анализ молекулы ДНК. Прибор подтвердил свою эффективность на модельной последовательности нуклеотидов.

Для реализации фантастических задумок молекулярных медиков и генных технологов ученым необходимо не только разрабатывать методы точечной доставки лекарственных средств, но и совершенствовать диагностику.

Краеугольный камень в решении этих вопросов – последовательность ДНК. Ее нужно расшифровать и найти болезнетворную ошибку в последовательности нуклеотидов. Зная, какая из «букв» генетического текста написана неверно, медики смогут корректировать патогенные последовательности или диагностировать болезни превентивно. То есть на той стадии, когда у человека еще нет никаких клинических признаков.

За прошедшие десятилетия исконный метод секвенирования ДНК удалось значительно доработать и модифицировать. Но ученые продолжают разрабатывать технологии, которые позволят считывать генетические последовательности быстро и недорого.

В свежем номере журнала PNAS появилась статья, в которой исследователи из Университета Вашингтона (University of Washington) и Университета Алабамы в Бирмингеме (University of Alabama Birmingham) описывают метод прямого анализа ДНК – без восстановления и реконструкции прежнего облика молекулы.

Считывать последовательность можно без специальных реагентов, флуоресцирующих белков и кропотливого восстановления прежнего облика ДНК. Для этого необходимо «заманить» одну из цепочек ДНК в нанопору — «пещеру» с лазом не менее 1 нм в диаметре. Подобная органическая или неорганическая «пещера», изменяя интенсивность ионного тока и соответственно напряжение, способна выполнять функции ДНК-томографа. То есть пока последовательность или ее участок пробирается через нанощель, чувствительный вольтметр фиксирует изменение напряжения. Далее по «электрическому портрету» элементарных нуклеотидных оснований (потенциалы которых известны) ученые способны описать молекулярную структуру.

Этот метод генетического анализа разрабатывается учеными всего мира с 1995 года. И если исследователи более или менее единогласно определились с тем, как «заманить» последовательность нуклеотидов в «ДНК-томограф» (с помощью ферментов или ионного тока), то устройство самого считывающего механизма еще предстоит доработать.

Например, профессор Кейс Деккер (Cees Dekker) и его коллеги из Дельфтского технологического университета (Delft University of Technology) предлагают использовать графеновые нанопоры, сконструированные на кремниевой пластинке. А Ян Деррингтон (Ian Derrington) и его коллеги из Университета Вашингтона (University of Washington) считают, что не нужно изобретать велосипед заново. Необходимо доработать уже имеющуюся технологию – протеиновую нанопору.

По словам исследователей, секвенатор должен быть именно белковым, а не графеновым или минеральным.

В отличие от неорганических нанопор протеиновая система легко поддается структурной модификации и может быть произведена с субнанометровой точностью», — пишут естествоиспытатели в журнале PNAS.

В арсенале нанотехнологов уже есть проверенная и запатентованная нанопора, в структуру которой входит хорошо изученный белок – альфа-гемолизин. Этот бактериальный протеин встраивается в клеточную мембрану и дырявит ее, формируя пору. Клетка с продырявленной мембраной теряет контроль над переносом веществ, заболевает и погибает.

Изучив свойства вредоносных гемолизинов, ученые общими усилиями приучили белок, заставив его секвенировать нуклеотиды. Однако структура гемолизиновой нанопоры создает некоторые ограничения для эффективного анализа ДНК. Так, из-за большой глубины канала (5 нм) специфичность нуклеотидов, выраженная напряжением ионного тока, уменьшается. То есть сигнал размывается — ученые могут перепутать нуклеотиды.

Исследователи решили побороться с этим недостатком и создали новую нанопору на основе протеина непатогенной микобактерии — Mycobacterium smegmatis. Бактериальный мембранный белок MspA порин формирует плотно связанную симметричную октамерную структуру в форме водоворота. В центре белковой воронки образуется канал глубиной всего 2 нм, через который микобактерии и получают гидрофильные соединения.

Исследователи предположили, что MspA порин сможет распознавать нуклеотиды.

MspA порин имеет избыточный отрицательный заряд, который также может создавать помехи, поэтому экспериментаторы с помощью генетических манипуляций нейтрализовали носителей избыточного заряда – три основания аспарагиновой кислоты.

Рис. 1. 3D−модель нанопоры в поперечном разрезе.

Ученые отмечают, что нанопора на основе MspA — потенциальный кандидат на роль эффективного и экономически выгодного секвенатора. На пространственной модели (рис.1) цветами отмечено распределение зарядов внутри «воронки». Красным и синим цветом обозначены положительно и отрицательно заряженные участки соответственно; сиреневые участки имеют двойной заряд (полярные основания); желтые и оранжевые — гидрофобные основания (парафиновые и ароматические). Сужение диаметром 1,2 нм позволяет пройти сквозь воронку всего лишь одному нуклеотиду.

Мутированный бактериальный белок исследователи поместили в ячейки (диаметр 20 микрон) липидного бислоя, натянутого на тефлоновую пластинку. Чтобы проверить собственную гипотезу и точность «молекулярного томографа», исследователи синтезировали ДНК с известной последовательностью нуклеотидов и пропустили ее через секвенирующую нанопору.

Рис. 2. Прохождение цепочки ДНК через нанопору.

Положительно заряженное основание чипа заставляло одинарную цепочку ДНК перемещаться по белковому каналу (a). Двойная спираль ДНК, которая остается на поверхности поры, притормаживает процесс и не позволяет одинарной цепочке проскользнуть через секвенирующую нанопорку слишком быстро (b). В это время датчик фиксирует изменение ионного тока.

По результатам эксперимента ученые пришли к выводу, что секвенатор на основе MspA порин способен различать все четыре типа нуклеотидов по изменениям ионного тока.

Результаты исследований изложены в статье Nanopore DNA sequencing with MspA.